RESUMEN:

Objetivos: Poner de manifiesto la evidencia existente entre los microRNAs y la enfermedad neoplásica, de forma especial con el cáncer colorrectal.

Estrategia de búsqueda: Revisión de la literatura sobre los microRNAs existente en PubMed.

Selección de estudios: Basada principalmente en la relevancia científica de las fuentes de información.

Síntesis de resultados:Los microRNAs son estructuras moleculares con actividad post-transcripcional que están implicados en la regulación de la expresión genética. Diversos estudios ponen de manifiesto la participación de los microRNAs con distintas funciones fisiológicas, así como con el proceso de la oncogénesis. La expresión de los microRNAs puede verse alterada en las neoplasias por su interacción bien con los genes supresores de tumores, bien con los oncogenes.

Conclusiones: El estado actual de los microRNAs hace necesario continuar con la investigación existente entre la etiopatogenia de las neoplasias y los microRNAs. El conocimiento de la verdadera implicación de los microRNAs en la fisiopatología de la enfermedad neoplásica, permitirá ampliar las supuestas aplicaciones clínicas de los microRNAs a la determinación del pronóstico de la enfermedad neoplásica.

ESTRATEGIA DE BÚSQUEDA Y SELECCIÓN DE ESTUDIOS

La revisión bibliográfica sobre la implicación de los microRNAs y el cáncer colorrectal se realizó en PubMed, iniciándose la búsqueda mediante las entradas: (colorectal cáncer OR colorectal neoplasms OR colorectal neoplasm) AND (MicroRNA OR microRNA OR microrna OR miRNA OR miR), sin ningún tipo de limitación. Se seleccionaron aquellas publicaciones que aportasen la información relevante para el desarrollo del presente trabajo.

SÍNTESIS DE RESULTADOS

1. Descubrimiento de los microRNAs

Fue en el año 1993 cuando se describió por primera vez la existencia de un gen denominado lin-4, que codificaba un pequeño ácido ribonucléico (RNA) con complementariedad hacia el gen lin-14. Como resultado de esta interacción se induciría una disminución de la expresión de la proteína LIN-14, demostrada por Lee et al. En la publicación The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. ¹

Lee et al. llevaron a cabo sus estudios en el Caenorhabditis elegans, siendo el primer organismo multicelular del que se secuenciaría íntegramente su genoma. En su proceso investigador descubrieron que el resultado de la transcripción del gen lineage-4 (lin-4) eran dos RNAs de pequeño de tamaño, entre 22 y 61 nucleótidos de longitud. La peculiaridad de estas pequeñas estructuras era la complementariedad hacia una secuencia repetida, a nivel de la región 3´ no traducida (untranslated region, UTR) del RNA mensajero (mRNA) lin-14, sugiriendo que el gen lin-4 regulaba la traducción del lin-14 mediante una interacción antisentido (3´- 4´) entre los RNAs. Asimismo, establecieron que el gen lin-4 no codificaba una proteína sino que daba lugar a dos moléculas de 22 y 61 nucleótidos, a las que terminaría por denominarse microRNAs (miRNA) con el paso del tiempo. ¹

La relevancia de este estudio radicó en constatar la implicación de estos genes en el desarrollo de C. elegans. El gen lin-4 actúa en las primeras etapas del desarrollo larvario, estando implicado en la sincronización del proceso de progresión en la totalidad de los estadios larvarios. De forma que, en los animales portadores de una mutación o con una pérdida de la función de este gen se produce un retraso inapropiado en los estadios del desarrollo. Las consecuencias de estos patrones de desarrollo heterocrónicos^ incluiría la ausencia de estructuras anatómicas adultas. ¹ Semejante fenotipo es una reminiscencia de múltiples tumores malignos humanos, como algunos derivados de los linajes hematopoyéticos, que resultan tras la expansión de una población de células precursoras que no han logrado alcanzar la diferenciación.

Con posterioridad, Reinhart et al. identificarían en la misma especie un nuevo gen, denominado lethal-7 (let-7), que daba lugar a un RNA de 21 nucleótidos de longitud. Evidenciaron que el let-7 era complementario a nivel de la zona 3´ de las regiones no traducidas de los genes lin-14, lin-28, lin-41, lin-42 y daf-12, indicando que la expresión de estos genes podría ser controlada directamente por el let-7. De modo semejante a lo que ocurría con el RNA lin-4, las alteraciones en la expresión de let-7 provocaban alteraciones en el desarrollo de C. elegans, incrementándose la evidencia de la participación de lin-4 y let-7 en la sincronización del desarrollo larvario de C. elegans. ²

2. Distribución de los microRNAs en el reino animal

Siguiendo en la línea de investigación de Lee et al., otros grupos iniciarían sus estudios sobre la Drosophila melanogaster. En ésta se demostraría la existencia de varios RNAs de pequeño tamaño, proponiéndose la capacidad de conservación de estas estructuras a lo largo de la escala filogenética pues se constataban tanto en los invertebrados como en los vertebrados. Lagos-Quintana et al. consiguieron obtener catorce miRNAs en la Drosophila melanogaster y diecinueve miRNAs en seres humanos.

Al mismo tiempo que se publicaban los resultados de Lagos-Quintana et al., otro grupo encabezado por Lau et al. propugnarían la integración de los stRNAs (small temporal RNA) en una gran familia de RNAs no codificantes, denominados microRNAs, con longitudes comprendidas entre 21 y 24 nucleótidos. Identificaron en el C. elegans un total de cincuenta y cinco miRNAs previamente desconocidos, estableciendo asimismo que estos miRNAs resultaban tras la participación de la enzima Dicer, en concordancia con los criterios de Lagos-Quintana. El enzima Dicer es una proteína ribonucleasa de la familia de RNasa III con varios dominios, cuyos productos de degradación se reconocen por tres criterios: 1º) Una longitud de aproximadamente 22 nucleótidos. 2º) Una terminación monofosfato a nivel de 5´. 3º) Un grupo hidroxilo en el extremo 3´. Entre sus conclusiones establecían que los miRNAs presentan diferentes patrones de expresión durante el desarrollo, y que su conservación evolutiva implicaba que los miRNAs tendrían amplias funciones de regulación en los animales. Proponiendo que estos pequeños RNAs no codificantes –miRNAs o microRNAs-, expresados y conservados a lo largo de la evolución, constituyen una clase de riboreguladores asociados a localizaciones específicas en los mRNAs, cuya funcionalidad radicaría en la regulación post-transcripcional directa de estos genes. ³

En relación a la disposición de los genes de los miRNAs en el genoma celular, se halló que formaban grupos de genes en dicha estructura citológica, como demostrara Lagos-Quintana et al. con respecto a los genes de los miR-3, miR-4, miR-5 y miR-6 en el genoma de la D. melanogaster. En tanto Lau et al, en el C. elegans, propugnarían que el conjunto de genes del miR-35 al miR-41 se transcribían de forma conjunta, dando lugar a un único precursor que, tras ser procesado, daría lugar a los miRNAs independientes. ⁴

3. Patogénesis y microRNAs

Una vez demostrada la existencia de los microRNAs en gusanos, moscas y seres humanos, era llegado el momento de ampliar y profundizar la investigación acerca de estas biomoléculas en la especie humana. Con esta orientación antropológica, Berezikov et al. secuenciaron 122 microRNAs en diez especies de primates para demostrar la conservación de los genes de los microRNAs. ⁵

Inicialmente, las funciones que desempeñan los microRNAs entre los animales se vislumbraron a través de diferentes mecanismos, involucrando a los microRNAs en la sincronización del desarrollo de gusanos, en la muerte celular programada en moscas, en el desarrollo temprano y tardío en vertebrados, así como en determinadas funciones fisiológicas en el hombre, tales como la diferenciación de los adipocitos, la defensa antiviral o la apoptosis. ⁶

Los microRNAs estarían involucrados en las vías de diferenciación de los tejidos y en diversos procesos fisiológicos. Como es el caso del miR-196 que participa en el desarrollo de los miembros inferiores o del miR-134 que contribuye al control de la traducción del mRNA necesario para el desarrollo de las sinapsis a nivel cerebral. Funciones fisiológicas en las que se ha mostrado la relevancia de los microRNAs serían: La diferenciación cutánea promovida por el miR-203. La secreción de insulina regulada por el miR-375 y el miR-124a. El desarrollo muscular por el miR-1. Constituyendo éstos meros ejemplos en los que se ha visto la participación de los microRNAs, pues se piensa que están involucrados en la regulación de multitud de dianas moleculares; de ahí, su importante contribución en gran número de funciones. ^7,8

Los primeros estudios que relacionaban los microRNAs con los procesos inmunológicos, se centraron en la expresión de los perfiles hematopoyéticos durante su desarrollo. En dichos estudios también se evidenció la participación de los microRNAs en el desarrollo de las células T, las células B y los granulocitos. El miR-150 desempeña una función crítica en la diferenciación de las células B al inhibir la transición entre los estadios pro-B a pre-B, en tanto que el miR-181a se ha identificado como un regulador positivo de la diferenciación linfocítica de tipo B y de la diferenciación de las células T tímicas. Otras participaciones de los microRNAs, que demuestran su decisivo papel en la hematopoyesis, son la que desempeña el miR-142 como regulador de la diferenciación de las células T y el miR-223 como modulador esencial de la diferenciación granulocítica. ⁹

Demostrada la participación de los microRNAs en la fisiopatología de la inflamación, con posterioridad surgirían nuevas relaciones de esta interacción. Así, a partir del estímulo desencadenante de la cascada inflamatoria se altera la expresión de los microRNAs, pudiendo tener algunos de éstos actividad oncogénica o supresora de tumores. En consecuencia, los microRNAs pueden ser mediadores de la carcinogénesis dependiente de la inflamación, como es el caso de miR-21 y miR-155. ¹⁰

Los microRNAs también participan en la patogenia de enfermedades no neoplásicas. En el corazón y en el músculo esquelético se expresan una amplia gama de microRNAs (miR-1, miR-21, miR-133, miR-181, miR-195, miR-206 y miR-208); alteraciones en su regulación conllevarán disfunciones, en cuanto a la diferenciación y la proliferación, que influirán decisivamente en el desarrollo de cardiopatías como la hipertrofia, la fibrosis y las arritmias. A nivel hepático, el miR-122 participa en el metabolismo de los lípidos y se encuentra implicado en la replicación del genoma del virus de la hepatitis C. ¹¹

Compendiando lo expuesto podría afirmarse que, multitud de estudios han demostrado que los microRNAs son responsables de la regulación de múltiples procesos biológicos: De índole metabólico, de proliferación, de diferenciación, de apoptosis, de del desarrollo y de la oncogénesis. Además, y dado que los microRNAs se expresan en una gran variedad de órganos y de tejidos, resulta sumamente factible su participación tanto en sus respectivos fisiologismos como en sus procesos fisiopatológicos específicos.

3. Oncogénesis y microRNAs

El paradigma de la oncogénesis -acumulo de mutaciones a nivel de los oncogenes y de los genes supresores de tumores- comenzaría a modificarse con la identificación de una nueva clase de RNAs no codificantes (ncRNA), sumamente importantes para el desarrollo y la homeostasia celulares. En este grupo de ncRNA se incluirían, como una clase especial los microRNAs, que paulatinamente fueron involucrados en la instauración de la enfermedad neoplásica.

Los genes que codifican los ncRNAs dan lugar a moléculas de RNA funcionante de longitud variable. A pesar del conocimiento parcial de la función de los microRNAs, se sabe que tienen funciones importantes en el desarrollo como quedó reflejado ad hoc al participar los stRNAs lin-4 y let-7 en la evolución del C. elegans. ¹²

La primera referencia en la que se hace alusión a la relación existente entre las neoplasias y los microRNAs se remonta al año 2002. En ese año, un estudio de Calin et al. demostró la relación que existía entre la leucemia linfática crónica (LLC) y los microRNAs miR-15 y miR-16, puesto que en la mayoría de casos de LLC sendos microRNAs mostraban valores bajos. Tanto el miR-15 como el miR-16 se encuentran localizados en el cromosoma 13q14, región que está deleccionada en más de la mitad de las leucemias linfáticas crónicas de células B. Más aún, las delecciones o las alteraciones de la expresión de estos dos microRNAs se han cifrado, aproximadamente, hasta en un 68% de las leucemias linfáticas crónicas. ¹³

La constatación en otras neoplasias de deleción a nivel del cromosoma 13q14, haría más patente la implicación de los microRNAs en el desarrollo de los tumores. Así, se ha detectado esta alteración genética en un 50% de los linfomas de células del manto, en un 16-40% de los mielomas múltiples y hasta en un 60% del cáncer de próstata. Cifras sugerentes de que uno o más genes supresores de tumores, situados en dicho locus, están involucrados en la génesis de las neoplasias. ¹³

Por tanto, los microRNAs pueden contribuir al proceso de la oncogénesis a través de dos mecanismos: 1) Alteraciones a nivel de los genes supresores de tumores, disminuyendo la expresión de éstos. 2) Alteraciones a nivel de los oncogenes, provocando un incremento de la actividad de los mismos.

En la línea de investigación sobre los microRNAs y las enfermedades tumorales, un nuevo estudio de Calin et al. incidiría sobre esta posible relación basándose en la localización de 186 microRNAs. Demostraron que los microRNAs se localizan frecuentemente en zonas frágiles de los cromosomas, así como en regiones de pérdida de heterocigosidad, en regiones mínimas de amplificación o en sitios frecuentes de ruptura. Evidenciando, finalmente, que las posiciones en el genoma de los microRNAs se relacionan con las alteraciones específicas del cáncer. ¹⁴

El conocimiento de las funciones de los microRNAs iba acrecentándose progresivamente. Ya se había determinado que eran pequeñas moléculas de RNA no codificante que regulan la expresión genética a nivel post-transcripcional, a través de la unión con el mRNA. Se establecería, en el año 2005, que los miRNAs regulaban hasta el 30% de los genes del genoma humano. Se había comprobado que muchos de los genes de estos microRNAs se localizaban en sitos previamente relacionados con el cáncer, lo que hacía suponer la íntima relación existente con este tipo de patología. Las primeras relaciones obtenidas demostraban una disminución de expresión de la mayoría de los microRNAs, como las alteraciones evidenciadas en la leucemia linfática crónica en relación con los miR-15 y miR-16 expuestas con anterioridad, aunque también se encontraron enfermedades en las que existía un incremento de los mismos. ⁵

Cáncer colorrectal y microRNAs

En el año 2003, Michael et al. llevaron a cabo el primer estudio que afrontaba los cambios en la expresión de los microRNAs en el adenocarcinoma de colon, intentando determinar la implicación que éstos pudieran tener en la carcinogénesis. Tras la extracción del RNA con longitudes entre dieciocho y veintisiete nucleótidos, se procedía a su purificación y clonación tanto en la muestra tumoral como en la mucosa libre de tumor. Se obtuvieron un total de 28 secuencias diferentes de microRNAs, unas ya conocidas y otras que no habían sido identificadas previamente. En su estudio evidenciaron que los microRNAs miR-143 y miR-145 mostraban unos niveles de expresión disminuidos, situación que podía ser debida bien a una disminución de la actividad de la Dicer en las células neoplásicas o bien a una reducción de la estabilidad de estos microRNAs. Análisis posteriores del estudio descartarían alteraciones de la expresión de Dicer y del componente RISC (RNA-induced silencing complex), entre el tejido neoplásico y la mucosa normal. Planteándose la posibilidad de que otros componentes de las vías de los microRNAs se hubiesen alterado durante el desarrollo neoplásico, aunque también podría ser debido a una disminución de sus dianas en las células tumorales. ¹⁵

Tras descubrir que la expresión de let-7 estaba disminuida en el cáncer de pulmón, Akao et al. supusieron que resultados semejantes deberían ser observados en el cáncer colorrectal. Con esta premisa investigarían en muestras tumorales de pacientes con adenocarcinoma colorrectal y sobre líneas celulares neoplásicas, obteniendo los resultados que habían previsto. El let-7 estaba disminuido en la zona tumoral con respecto a la mucosa sana adyacente, al igual que acontecía en los estudios sobre líneas celulares neoplásicas. ¹⁶ Con anterioridad se había evidenciado, en estudios sobre el cáncer de pulmón, que let-7 regulaba negativamente la expresión de la proteína RAS. Mientras que let-7 se expresaba en el tejido pulmonar adulto sano, en las neoplasias pulmonares se encontraba disminuido. El hecho de que en diversos mapas genéticos se hubiera observado, en el cáncer de pulmón, que la región de let-7 se encontraba deleccionada y que la sobreexpresión de let-7 inhibía el crecimiento in vitro del tumor, indujo a la conclusión de que la familia de let-7 regulaban la expresión de RAS. ¹⁷

A partir de los conocimientos previos sobre la fisiopatología neoplásica, se seguirían buscando relaciones entre el cáncer de colon y los microRNAs. El hallazgo de que el c-Myc regulaba la expresión de varios microRNAs, llevó a investigar las posibles relaciones entre el gen supresor de tumores p53 -como factor de transcripción- y la expresión de los microRNAs -como reguladores de la expresión genética a nivel post-transcripcional-. ¹⁸ El p53 no sólo es uno de los principales reguladores que controlan el ciclo celular y la apoptosis, sino que además actúa como proteína de unión al RNA con capacidad para autoregular la traducción de su mRNA y la transcripción de otros mRNAs a nivel post-transcripcional. Xi et al. buscaron la relación que podía existir entre el p53 y los microRNAs en el cáncer de colon, dada su doble funcionalidad y por ser el p53 uno de los factores de transcripción frecuentemente alterado, debido a mutaciones y delecciones, en el carcinoma colorrectal. Tras su estudio evidenciaron que en las muestras tumorales había un incremento de la expresión de once microRNAs y una disminución de cuarenta y tres microRNAs, por la acción del p53 como factor de transcripción y por el mecanismo post-transcripcional secundario a su unión con el RNA. ¹⁸

Otros grupos enfocarían el proceso de la carcinogénesis colorrectal hacia la relación existente entre la neoplasia y la inestabilidad de los microsatélites. En un análisis que estudiaba la relación entre el mRNA y el miRNA, se evidenció una expresión diferente del miRNA al comparar muestras de tejido tumoral con inestabilidad de los microsatélites frente a muestras con microsatélites estables. Ante el hallazgo de una mayor expresión de miR-17-92 en los adenocarcinomas de colon con estabilidad de los microsatélites, se concluyó que estos microRNAs participaban en la diferenciación entre ambos estados de diferenciación genética. ¹⁹

Monzo et al., basándose en que los microRNAs son esenciales para la regulación de la diferenciación celular y para el mantenimiento del estado pluripotencial de las células madre, llevaron a cabo un estudio en el que comparaban la expresión de los microRNAs en tejidos embrionarios de entre 7 y 12 semanas, en tejido tumoral y en tejido normal. Evidenciaron que el conjunto miR-17-92 y su diana E2F1, mostraban un patrón similar en el desarrollo embriológico del tejido colónico humano y en la carcinogénesis del cáncer colorrectal. Concluyendo que la expresión de los microRNAs podría modular la expresión genética de las vías de señalización, tanto para el desarrollo intestinal como para el desarrollo tumoral. ²⁰

Consecuente con el interés por determinar los microRNAs relacionados con el cáncer colorrectal, se publicaron múltiples estudios que relacionarían la diferente expresión de los microRNAs en las neoplasias colónicas. Estas investigaciones encontraron valores disminuidos de los microRNAs miR-31, miR-96, miR-133b, miR-135b, miR-145 y miR-183, objetivándose que la expresión del miR-31 se relacionaba con el estadio de la enfermedad. ²¹ Otros autores hallaron valores incrementados del miR-21. ^22,23 Surgiendo innumerables relaciones de expresión/pronóstico entre el cáncer colorrectal y la expresión de los microRNAs.

CONCLUSIONES

El estado actual de los microRNAs hace necesario continuar con la investigación existente entre la etiopatogenia de las neoplasias y los microRNAs. El conocimiento de la verdadera implicación de los microRNAs en la fisiopatología de la enfermedad neoplásica, permitirá ampliar las supuestas aplicaciones clínicas de los microRNAs a la determinación del pronóstico de la enfermedad neoplásica.

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